Klonieren von humanen Ankerproteinen der Haut
Klonieren von humanen Ankerproteinen der Haut auf der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Salzburg
Sigrid Wagner mit der 6S und 7L
Ich bin sehr froh, dass wir von Dr. Michael Löffler auf der Uni so herzlich aufgenommen und optimal betreut wurden. Sowohl die 6S als auch die 7L durften je 2 Tage an aktueller Forschung teilhaben und Ankerproteine der Haut und Ribosomale Proteine klonieren.
Nach einer kurzen Einführung ins Pipettieren durften wir loslegen. Zu allererst bereiteten wir unsere Humangene (Ankerproteine der Haut) für das Kopieren im Thermocycler (Gerät für die automatische PCR (Polymerase Chain Reaction)) vor. Dafür mussten wird zu den Genen unter anderem einen vorderen und einen hinteren Primer, das Enzym Polymerase (isoliert aus dem Bakterium Thermus aquaticus), 4 verschiedene DNA-Nucleotide,… hinzufügen. Es war sehr eigenartig mit Flüssigkeitsmengen von 1-2 Mikrolitern zu arbeiten, da man sie fast nicht sehen kann. Immer wieder sagten wir: „Da ist ja nix drin!“ Unser Gemisch steckten wir dann für die Amplifizierung (Vermehrung von DNA- Abschnitten) in den Thermocycler.
Während wir ca. 1,5 h auf die millionenfachen Kopien der humanen Gene warteten, kochten wir Nährböden für Bakterien. Die Bakterien, in unserem Fall E. coli, lieben Vieles, was auch wir mögen z.B. Zucker, Salz und Hefe. Genaues Wiegen und ruhige Hände waren unabdinglich. Unsere Nährlösung musste dann gerührt, erhitzt und wieder abgekühlt werden. Als das Nährmedium die optimale Temperatur, nicht zu heiß (sonst wäre die Wirkung des Antibiotikums herabgesetzt worden) und nicht zu kalt (sonst wäre die Nährlösung fest geworden) hatte, fügten wir Ampicillin, ein Antibiotikum, hinzu, welches uns später für die Selektion der Bakterien, die unser ligiertes Gen enthielten, hilfreich war. Nun konnte das „Futter für die Bakterien“ in Petrischalen gegossen werden.
Zudem blieb noch Zeit ein Agarosegel für den Gelelektrophoreseapparat herzustellen. Für diejenigen, für die es gerade keine Beschäftigung gab, war das Spitzennachfüllen fürs Pipettieren angesagt. Mit Handschuhen waren diese kleinen Spitzen gar nicht so leicht in die dafür vorgesehenen Boxen zu füllen.
Dann war es so weit! Die DNA lag in unzähligen Kopien vor uns. Diese trennten wir durch Elektrophorese auf. Dafür mussten die DNA-Proben mit einer Pipette in sogenannte „Taschen“ gefüllt werden. Durch das Anlegen von Gleichspannung wurden die Proben der Länge nach aufgetrennt und es bildeten sich Regionen mit gleich langen DNA-Stücken, die Banden. Im UV-Licht konnten diese sichtbar gemacht werden. Brauchbare DNA-Stücke schleusten wir in Bakterienplasmide, das sind ringförmige doppelsträngige DNA- Ringe, ein, und transformierten sie in E. coli. Die Bakterien übertrugen die Schüler dann auf die Nährböden in den Petrischalen, die inzwischen fest geworden sind. Über Nacht konnten sich unsere genetischen Helferlein im Wärmeschrank vermehren.
Am nächsten Tag pickten wir die Klone, einen Teil ließen wir auf LBamp- Platten austropfen, außerdem ließen wir Bakterien in einem Flüssignährmedium hochwachsen, führten eine PCR von gepickten Konen durch, holten die Plasmide durch Lyse von Bakterien wieder heraus, befüllten Spitzenboxen zwischendurch, zentrifugierten und pipettierten, stellen nochmals Agarosegel her, freuten uns über positiv identifizierte Klone und schickten die Plasmide zum Sequenzieren ab. Hoffentlich kann die Arbeitsgruppen rund um Dr. Löffler, der sehr viel Geduld mit uns bewiesen hat, mit unseren „Produkten“ weiterarbeiten.
Wir sind ihm überaus dankbar für seinen geleisteten Einsatz und seine Bereitschaft, den Schülern die Genetik schmackhaft zu machen. Wer weiß, vielleicht sehen wir uns mal wieder!
Eindrücke der 6s
Einige Schüler waren von der Ausstattung (insbesondere vom Thermocycler) des Labors beeindruckt, andere fanden es toll, dass sie so viel selbst arbeiten konnten. Vor allem das Pipettieren und Auffüllen der Pipettenspitzen bereitete großes Vergnügen. Einige hatten das Gefühl, dass sie beim Arbeiten sehr viel Verantwortung hatten, was aber gut war. Manche Schüler fanden die Inputs etwas zu komplex oder die Arbeitsphasen zu lange, aber im Großen und Ganzen war es für die meisten „zukünftigen Mikrobiologen oder Genetiker“ eine tolle Erfahrung und extrem spannend den Laboralltag einmal erleben zu können.
Sigrid Wagner, 6S und 7L